La señalización del receptor tipo Toll (TLR) es crucial para la protección frente a una infección patógena, además de para modular la mejora de los tejidos. La activación de varios TLR desencadena respuestas inflamatorias generalizadas equivalentes a la inducción de citoquinas. Aquí, revelamos impactos diferenciales de TLR3 y TLR7 de señalización en los perfiles transcriptómicos en macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs).
Aparte de la autorregulación, TLR3, pero no TLR7, indujo la expresión de diferentes TLRs, lo que sugiere que la activación de TLR3 mejora globalmente la inmunidad innata. Además, observamos numerosas influencias de la señalización de TLR3 y TLR7 en genes relacionados con las vías de la metilación, la caspasa y la autofagia.
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En contraste endógeno TLR3 y TLR7 mediante la utilización de CRISPR / Cas9 experiencia para golpear en una etiqueta gemela Myc-HA en los extremos 3 ‘de ratón Tlr3 y Tlr7. Utilizando anticuerpos anti-HA para detectar TLR3 y TLR7 endógenos etiquetados, descubrimos que cada TLR muestra una expresión tisular y modificaciones postraduccionales diferenciales.
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El etiquetado C-terminal no perjudicó el ejercicio de TLR3. Sin embargo, interrumpió la interacción entre TLR7 y la respuesta principal de diferenciación mieloide 88 (MYD88), el adaptador de TLR7 que contiene el dominio Tir, que bloqueó su señalización descendente esencial para desencadenar la expresión de citoquinas y quimioquinas. Nuestra investigación demuestra propiedades completamente diferentes para TLR3 y TLR7, y además da útiles modas de ratón para la investigación adicional de los dos ARN-sensing TLRs.
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De corta duración AUF1 p42-vinculante mRNAs de RANKL y BCL6 tienen dos componentes distintos de inestabilidad cada uno.
Regulación de la estabilidad de ARNm por ARN-proteína interacciones contribuye considerablemente a puntos cuantitativos de la expresión génica. Ahora hemos reconocido potenciales dianas de ARNm de la proteína de unión a ingredientes ricos en AU AUF1. Myc-etiquetados AUF1 p42 fue inducida en células de ratón NIH/3T3 y RNA-proteína complejos remoted utilizando anti-myc etiqueta de anticuerpos perlas.
Seguro mRNAs se habían analizado con Affymetrix microarrays. Ahora hemos reconocido 508 objetivo potencial mRNAs que había sido un mínimo de 3 veces enriquecido en comparación con las células de gestión sin myc-AUF1. El 22,3% de los ARNm enriquecidos tenían un clúster rico en AU dentro de la base de datos ARED Organismo, frente al 16,3% de los ARNm de gestión no enriquecidos.
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El enriquecimiento en dirección a componentes ricos en AU se observó además por AREScore con un valor medio de 5,2 en los ARNm enriquecidos frente a 4,2 en el grupo de gestión. Sin embargo, se habían enriquecido bastantes ARNm sin un valor ARE excesivo. El enriquecimiento de secuencias tetraméricas y pentaméricas sugiere un amplio espectro de unión de AUF1 p42 a secuencias breves ricas en U flanqueadas por A o G.
No obstante, algunos ARNm enriquecidos habían sido extremadamente inestables, como los de TNFSF11 (a menudo denominado RANKL), KLF10, HES1, CCNT2, SMAD6 y BCL6. Ahora hemos mapeado entre los determinantes de la inestabilidad. El ARNm de HES1 parecía tener un determinante de área de codificación.
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Evaluación detallada de la RANKL y BCL6 3’UTR reveló para cada uno que la inestabilidad completa requiere dos componentes, que se conservan en la evolución. En RANKL ARNm cada uno de los componentes son ricos en AU y separados por 30 bases, mientras que en BCL6 ARNm uno es rico en AU y 60 bases de un ingrediente no ricos en AU que, sin duda, las variedades de un tallo-bucle de construcción.
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| L1033-.1 | ApexBio |
| DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library | |
| L1033-.25 | ApexBio |
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| L1033-5 | ApexBio |
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| T7 DNA | |
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Detección y purificación de proteínas backbone-cyclized utilizando un anticuerpo de cadena simple anti-myc-tag expresado bacterialmente.
Un myc-tag y cuyo reconocimiento por un anticuerpo 9E10 se ha utilizado durante mucho tiempo para la detección y purificación de proteínas recombinantes. Ahora hemos ampliado de antemano la aplicación de la etiqueta a la detección particular y la purificación de proteínas backbone-ciclado. Aquí buscamos un método más sensible para utilizar el anticuerpo 9E10 expresando su tipo de anticuerpo de cadena simple (scAb) en Escherichia coli.
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El uso mixto de un promotor T7 robusto y la técnica de autoinducción ligeramente que temprano a mediados de la inducción log de un promotor Lac resultó dentro de la sobreexpresión soluble de 9E10 scAb. Sin embargo, la co-expresión de una chaperona, Skp, era completamente obligatorio para el ejercicio, incluso cuando la proteína se expresó en un método soluble.
Podríamos purificar alrededor de Cuatro mg de 9E10 scAb de 1 l de la tradición, y la consiguiente scAb podría ser utilizado para detectar y purificar la columna vertebral-cyclized proteína porque los padres de longitud completa 9E10. Además, la resina de inmunoafinidad listo utilizando 9E10 scAb podría ser regenerado un número de ocasiones después de la elución de proteínas seguras utilizando un ácido, que añade valor adicional a la preparación preparada del anticuerpo energético en microorganismo.
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Prion protein “gamma-cleavage”: characterizing a novel endoproteolytic processing occasion.
La proteína priónica móvil (PrP(C)) es una proteína de expresión ubicua cuyo funcionamiento, por el momento, no está resuelto, pero es indudable que es numeroso. De relevancia putativa para el ejercicio orgánico regular, la PrP(C) es reconocida por soportar cada α- y β-endoproteólisis, produciendo los pares de fragmentos de escisión N1/C1 y N2/C2, respectivamente.
Pruebas experimentales sugieren la probabilidad de que estas ocasiones de procesamiento sirvan a diferentes necesidades móviles. Por medio de la ingeniería de un C-terminal c-myc etiqueta en murino PrP(C), además de la utilización selectiva de un lejano-C-terminal anti-PrP anticuerpo, hemos reconocido un nuevo fragmento de PrP(C), nominalmente ‘C3’, y la elaboración de la nomenclatura actual, ‘γ-corte’ porque la proteólisis responsable.
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Nuestra investigación señala que esta nueva γ-cleavage ocasión puede ocurrir durante el tránsito a través de la vía secretora después de salir del retículo endoplásmico, y después de PrP (C) ha alcanzado el suelo de la célula, por un metaloproteasa matriz. Descubrimos que la C3 está anclada a GPI, al igual que otras especies de PrP(C) C-terminal y de tamaño completo, aunque no se localiza principalmente en el suelo celular y se escinde preferentemente a partir de un sustrato no glicosilado.
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Es importante destacar que nos dimos cuenta de que C3 existe en numerosos tipos de células, además de ratón y el tejido de la mente humana, y de potencial importancia patógena, γ-clavado podría mejorar en las enfermedades priónicas humanas. Dada la indudable relevancia de PrP (C) de procesamiento para cada uno de su funcionamiento regular, y la susceptibilidad a la enfermedad priónica, la importancia potencial de este antes subestimado y descuidado escisión ocasión justifica la consideración adicional.
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Expresión de una proteína que contiene un péptido aceptor de biotina con potencial incorporación en la envoltura lentiviral como plataforma de ingeniería de suelo viral.
Los vectores lentivirales son uno de los muchos vectores virales prometedores en las funciones de la terapia génica, sin embargo, la eficacia de su concentración debe ser mejorada. El sistema adaptador de (estrept)avidina-biotina es un método novedoso para cambiar la envoltura lentiviral y lograr una mayor concentración. En este trabajo describimos la utilización de este sistema adaptador mediante el diseño de un péptido aceptor de biotina (BAP) portador de la proteína candidata de la envoltura y el análisis de su expresión en células 293T.
Para ello, se diseñó y sintetizó en tándem una secuencia de ADN que contenía enlazadores versátiles, un BAP de 15 aminoácidos y determinadas zonas de membrana de una proteína viral. El gen sintetizado se amplificó con la respuesta en cadena de la polimerasa para incorporar los sitios web de restricción BglII y SalI y se subclonó en los sitios web idénticos del vector pDisplay en cuerpo con la etiqueta HA y el epítopo myc para ensamblar el pDis-GS-BAP.
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Las células 293T se transfectaron con pDis-GS-BAP y la expresión de la proteína resultante (dis-GS-BAP) se evaluó mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-HA tag. La eficacia del proceso de transfección se evaluó mediante el vector pEGFP-N1 y el seguimiento de la expresión de la proteína fluorescente inexperta mediante microscopía de fluorescencia.
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La evaluación de la restricción y la secuenciación del ADN confirmaron la precisión de los pasos de clonación. La microscopía de fluorescencia indicó una eficacia de transfección superior al 70% y la evaluación por Western blot de células 293T transfectadas con pDis-GS-BAP confirmó una banda proteica de aproximadamente 17 kDa equivalente a la dimensión prevista de la proteína dis-GS-BAP. Estos prometedores resultados señalan la oportunidad de la expresión en el suelo celular y la biotinilación adicional de la proteína dis-GS-BAP en investigaciones en curso.
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